SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

ANALISIS KADAR BIOMOLEKUL

PROTEIN/ASAM AMINO MENGGUNAKAN SPEKTROFOTOMETER UV-VIS

 (Makalah Biokimia Fisik)

Oleh:

Tyas Rosawinda Kh
(0917011048)

 

 

Jurusan Kimia

Fakutas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Universitas Lampung

2013




I.       PENDAHULUAN
                                                       

A.    Latar Belakang

Protein merupakan zat yang berguna bagi kebutuhan manusia. Protein memiliki fungsi yaitu untuk membangun sel tubuh baru dan mengganti sel lama yang telah rusak. Pengukuran kadar peotein suatu bahan sangat diperlukan karena kandungan protein yang dimiliki setiap bahan makanan berbeda-beda.

Pengukuran kadar protein dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer UV–VIS.  Prinsip dasar analisis kualitatif maupun kuantitatif dengan spektrofotometer adalah reaksi antara radiasi elektromaknetik dari sinar UV-VIS dengan elektron dari sampel. Karena memiliki fungsi sebagai gelombang sekaligus sebagai materi, radiasi elektromagnetik menjadi bermanfaat. Sebagai gelombang, radiasi elektromagnetik mempunyai panjang gelombang tertentu sehingga menimbulkan efek warna yang dapat dilihat dengan jelas. Sebagai materi, gelombang elektromagnetik mempunyai energi yang dapat berinteraksi dengan partikel dari sampel.

Jika cahaya (radiasi elektromaknetik) mengenai suatu sampel, maka sebagian energinya akan diserap oleh molekul sampel sehingga elektron-elektronnya menjadi tereksitasi ke tingkat yang lebih tinggi. Besar perbedaan tingkat energi ground state (energi tingkat dasar) dengan tingkat energi tereksitasi untuk setiap molekul tidak sama. Maka dari itu, panjang gelombang optimum yang dimiliki sampel yaitu panjang gelombang dimana energi yang dimiliki gelombang itu besarnya sama dengan yang dibutuhkan untuk mengeksitasi elektron-elektron bahan. Jumlah energi yang diserap sebanding dengan jumlah materi sampel, sehingga spektrofotokopi dapat digunakan untuk uji yang bersifat kuantitatif.

1    B. Tujuan

Adapun tujuan pembuatan makalah ini adalah untuk memberikan informasi mengenai  tata cara analisis kadar biomolekul protein/asam amino menggunakan spektrofotometer uv-vis

II.           ISI

A.       Protein

Protein merupakan makromolekul polipeptida yang tersusun dari sejumlah asam-asam amino yang dihubungkan oleh ikatan peptida dan mempunyai bobot molekul 5000 sampai berjuta-juta. Satu molekul protein disusun oleh sejumlah asam amino tertentu dengan susunan yang khas untuk masing –masing protein (Aisyah, 1998).

Protein pada setiap sampel kadarnya berbeda-beda.  Pengukuran kadar protein suatu sampel sangat diperlukan karena erat kaitannya dengan tingkat konsumsi manusia. Pengukuran kadar protein dengan menggunakan metode Lowry adalah dasar dari penggunaan spektrofotometer. Metode ini dapat mengukur kadar protein sampai dengan 5 mikogram. Warna biru yang terjadi oleh pereaksi Ciocalteau disebabkan reaksi antara protein dan Cu dalam larutan alkalis dan terjadi reaksi pembentukan garam fosfomolibdat oleh tirosin dan triptopan dengan pereaksi Ciocalteau (Ahmad, 1997).

Konsentrasi protein diukur berdasarkan optical dencity pada panjang gelombang tertentu untuk mengetahui banyaknya protein dalam larutan. Protein dengan garam fosfotungstat pada suasana alkalis akan memberikan warna biru yang intensitasnya tergantung pada konentrasi protein terteta (Arthur, 1996).

Analisa Kjeldahl dapat digunakan untuk menganalisis kadar protein dalam sampel bahan makanan secara tidak langsung. Analisa ini digunakan untuk mengetahui kadar protein dengan menggunakan asam sulfat pekat dengan katalis selenium oksiklorida. Cara ini merupakan cara yang sederhana dan mudah dilakukan (Basari, 1997).

B.     Spektrofotometri uv–vis

Spektrofotometri Sinar Tampak (UV-Vis) adalah pengukuran energi cahaya oleh suatu sistem kimia pada panjang gelombang tertentu (Day, 2002).  Sinar ultraviolet (UV) mempunyai panjang gelombang antara 200-400 nm, dan sinar tampak (visible) mempunyai panjang gelombang 400-750 nm. Pengukuran menggunakan spektrofotometer melibatkan energi elektronik yang cukup besar pada molekul yang dianalisis, sehingga spektrofotometer UV-Vis lebih banyak dipakai untuk analisis kuantitatif dibandingkan kualitatif.  Konsentrasi dari analit di dalam larutan sampel bisa ditentukan dengan mengukur absorbansi sinar oleh sampel pada panjang gelombang tertentu dengan menggunakan hukum Lambert-Beer (Rohman, 2007).

Hukum Lambert-Beer menyatakan hubungan linieritas antara absorbansi dengan konsentrasi larutan analit dan berbanding terbalik dengan transmitan. Dalam hukum Lambert-Beer terdapat beberapa batasan, yaitu :

a.       Sinar yang digunakan dianggap monokromatis.

b.      Penyerapan terjadi dalam suatu volume yang mempunyai penampang yang sama.

c.       Senyawa yang menyerap dalam larutan tersebut tidak tergantung terhadap yang lain dalam larutan  tersebut.

d.      Tidak terjadi fluorensensi atau fosforisensi.

e.       Indeks bias tidak tergantung pada konsentrasi larutan.

Hukum Lambert-Beer dinyatakan dalam rumus sbb :

 A= E.b.c

 dimana :
A = absorban
E= absorptivitas molar
b = tebal kuvet (cm)
c = konsentrasi

1.      Sumber cahaya

Sumber cahaya pada spektrofotometer harus memiliki panacaran radiasi yang stabil dan intensitasnya tinggi.  Sumber cahaya pada spektrofotometer UV-Vis ada dua macam :

a)      Lampu Tungsten (Wolfram) digunakan untuk mengukur sampel pada daerah tampak (visible).  Bentuk lampu ini mirip dengan bola lampu pijar biasa.  Memiliki panjang gelombang antara 350-2200 nm.  Spektrum radiasianya berupa garis lengkung.  Umumnya memiliki waktu 1000 jam pemakaian.

b)      Lampu Deuterium dipakai pada panjang gelombang 190-380 nm.  Spektrum energi radiasinya lurus dan digunakan untuk mengukur sampel yang terletak pada daerah UV.  Memiliki waktu 500 jam pemakaian.

2.      Wadah Sampel

Wadah yang digunakan untuk sampel dalam pengukuran menggunakan alat spektrofotometer disebut dengan kuvet.  Kuvet kaca digunakan untuk analisis senyawa menggunakan sinar tampak (Visible).  Sedangkan kuvet kuarsa dan kuvet kaca silika digunakan untuk analisis menggunakan sinar ultraviolet. .

3.      Monokromator
Monokromator adalah alat yang akan memecah cahaya polikromatis menjadi  cahaya tunggal (monokromatis) dengan komponen panjang gelombang tertentu.  Bagian-bagian monokromator, yaitu :

a.       Prisma

Prisma akan mendispersikan radiasi elektromagnetik sebesar mungkin supaya di dapatkan resolusi yang baik dari radiasi polikromatis.

b.      Grating (kisi difraksi)

Kisi difraksi pectr keuntungan lebih bagi proses spektroskopi. Dispersi sinar akan disebarkan merata, dengan pendispersi yang sama, hasil pectrum akan lebih baik. Selain itu kisi difraksi dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spectrum.

c.       Celah optis

Celah ini digunakan untuk mengarahkan sinar monokromatis yang diharapkan dari sumber radiasi. Apabila celah berada pada posisi yang tepat, maka radiasi akan dirotasikan melalui prisma, sehingga diperoleh panjang gelombang yang diharapkan.

d.      Filter

Berfungsi untuk menyerap warna komplementer sehingga cahaya yang diteruskan merupakan cahaya berwarna yang sesuai dengan panjang gelombang yang dipilih.

4.      Detektor

Detektor akan menangkap sinar yang diteruskan oleh larutan.  Sinar kemudian diubah menjadi sinyal listrik oleh amplifier dan dalam rekorder akan ditampilkan dalam bentuk spectrum pada Visual display/recorder.  Detektor dapat memberikan respon terhadap radiasi pada berbagai panjang gelombang. 

5.      Visual display/recorder 
Merupakan sistem baca yang memperagakan besarnya isyarat listrik, menyatakan dalam bentuk % Transmitan maupun Absorbansi.

C.    Prinsip Kerja Spektrofotometri UV-VIS

Cahaya yang berasal dari lampu deuterium maupun wolfram yang bersifat polikromatis diteruskan melalui lensa menuju ke monokromator pada spektrofotometer dan filter cahaya pada fotometer.  Monokromator kemudian akan mengubah cahaya polikromatis menjadi cahaya monokromatis (tunggal).  Berkas-berkas cahaya dengan panjang tertentu kemudian akan dilewatkan pada sampel yang mengandung suatu zat dalam konsentrasi tertentu.  Oleh karena itu, terdapat cahaya yang diserap (diabsorbsi) dan ada pula yang dilewatkan. Cahaya yang dilewatkan ini kemudian diterima oleh detektor.  Detektor kemudian akan menghitung cahaya yang diterima dan mengetahui cahaya yang diserap oleh sampel.  Cahaya yang diserap sebanding dengan konsentrasi zat yang terkandung dalam sampel sehingga akan diketahui konsentrasi zat dalam sampel secara kuantitatif dengan membandingkan absorbansi sampel dan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumine).

D.    Hal–Hal yang Perlu Diperhatikan dalam  Proses Analisis Menggunakan Spektrofotometer UV-VIS

1.         Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna.  Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna, kecuali apabila diukur dengan menggunakan lampu UV.

2.         Panjang gelombang maksimum yang digunakan adalah panjang gelombang yang menghasilkan absorbansi maksimal.  Hal ini dikarenakan pada panjang gelombang maksimal, kepekaan alat terhadap tingkat absorbansi sampel semakin tinggi.  Selain itu, pada panjang gelombang maksimal akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat terpenuhi dan tingkat kesalahan pada pengukuran ulang akan semakin kecil.

3.      Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan cahaya yang diabsorbsi oleh sampel.  Tiap sampel akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung pada senyawa yang terbentuk.  Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang dan absorbansi pada spektrofotometer agar pengukuran yang didapatkan lebih teliti dan akurat.

E.     Pembuatan Pereaksi dan Penentuan Kadar Protein Menggunakan Metode Lowry (Lowry et al., 1951)

Pereaksi A                : 2 gram Na₂CO₃ dilarutkan dalam 100 mL NaOH   0,1 N.

Pereaksi B                 : 5 mL larutan CuSO₄.5H₂O 1% ditambahkan ke dalam 5 mL larutan Na(K) tartarat 1%.

Pereaksi C                : 2 mL pereksi B ditambahkan 100 mL pereaksi A

Pereaksi D                : reagen folin ciocelteau diencerkan dengan akuades 1:1.

Larutan standar        : larutan BSA (Bovine Serum Albumin) dengan kadar 0, 20, 40, 60, 80, 100, 120, dan 140 ppm.

Kadar protein ditentukan dengan metode Lowry (Lowry et al., 1951).  Sebanyak 0,1 mL sampel ditambahkan 0,9 mL akuades lalu direaksikan dengan 5 mL pereaksi C dan diaduk rata.  Kemudian dibiarkan selama 10 menit pada suhu ruang.  Setelah itu ditambahkan dengan cepat 0,5 mL pereaksi D dan diaduk dengan sempurna, didiamkan selama 30 menit pada suhu kamar.  Untuk kontrol, 0,1 mL sampel diganti dengan 0,1 mL akuades, selanjutnya perlakuannya sama seperti sampel.  Serapannya diukur menggunakan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang 750 nm.  Untuk menentukan konsentrasi protein enzim digunakan kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).

F.     Contoh Perhitungan Kadar Protein Metode Lowry Menggunakan Spektrofotometer UV-VIS

1.      Kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).

Tabel 1.  Absorbansi serum albumin sapi (BSA)  pada berbagai konsentrasi untuk penentuan Kurva standar BSA (Bovine Serum Albumin).

No	Konsentrasi BSA (μg mL-1)	Absorbansi (λ = 750)
1	20	0,066
2	40	0,119
3	60	0,167
4	80	0,212
5	100	0,269
6	120	0,297
7	140	0,350

Gambar 20.  Kurva standar serum albumin sapi (BSA)

Gambar 1.  Kurva standar BSA (Bovine Serum Albumine)

2.      Data Absorbansi Sampel

Tabel 2.  Pengukuran absorbansi sampel

Sampel	Absorbansi sampel	Absorbansi Kontrol
Susu	0,0687	0,0492

   

3.      Perhitungan Kadar Protein dalam Sampel

Diketahui :

X = Kadar Protein

Y = absorbansi

y = a + bx

a = 0,014

b = 0,002

r = 0,994

*  Persamaan Garis Regresi

Y = Absorbansi sampel – Absorbansi kontrol

Y = a + bX

X = ((Y – a)/b)) x (FP)

X = ….mg/L

X = ….x 10^-3 mg/mL                  Kadar protein

 

*   Perhitungan Kadar Protein pada Sampel Susu

Y = 0,014 + 0,002X

Y = 0,0687 – 0,0492

Y = 0,0195

X = ((0.0195– 0,014)/ 0,002)) x (10)

X = 27,5 mg/L

X = 27,5 x 10^-3

X = 0,0275 mg/mL

Jadi, dalam 1 mL sampel susu tersebut terkandung 0,0257 mg protein.

III.             KESIMPULAN

Dari isi makalah ini, maka diperoleh beberapa kesimpulan sebagai berikut :

1.       Spektrofotometer merupakan salah satu alat yang dapat digunakan untuk mrngukur absorbansi dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang tertentu.

2.       Prinsip kerjannya yaitu reaksi antar radiasi elektromagnetik dengan partikel sampel.

3.       Semakin tinggi konsentrasi maka semakin tinggi nilai absorbansi BSA.

4.       Pada makalah ini, absorbansi susu sebesar 0,0687dan absorbansi kontrol sebesar 0,0492.

5.       Kekurangan metode Lowry adalah sensitif terhadap perubahan pH dan konsentrasi protein yang rendah. Oleh karena itu sampel harus diencerkan sebanyak 10 kali.

6.       Pada makalah ini, kadar protein dalam sampel susu adalah 0,0275 mg/mL.

DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, 1997, Kimia Dasar, Prinsip, dan Terapan Modern. Jakarta : Erlangga.

Aisyah, 1998. Kimia Untuk Universitas. Jakarta : Gramedia.

Arthur, 1996. Kimia Anorganik. Jakarta: Erlangga.

Basari, 1997.  Kimia Dasar. Kudus : PT. Gunung Muria.

Lowry, O. H., N. J., Rosebrough, A. L., Farr, R. J. Randall. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193-265.

Polling, 1996. Panduan Prantikum. Bandung : CV. Manggala Offset.

http://zaidanalrazi.blogspot.com/2012/04/spectrofotometrer-uv-vis.html

http://catatankimia.com/catatan/spektofotometri-uv-vis.html

http://pangestu-ayupangestu.blogspot.com/2011/12/spektrofotometer-uv-vis.html

http://aaknasional.wordpress.com/2012/06/08/spektrofotometer-uv-vis/

Tweet